Augu kallusu DNS izdalīšana un metilēšana

1.4.2. DNS izdalīšana ar CTAB metodi
Šajā etapā polisaharīdi, fenolie savienojumi, olbaltumvielas un citi šūnu līzes komponenti, kuri atrodas ūdens šķīdumā, atdalās no nukleīnskābju CTAB kompleksa.
Polisaharīdu kā arī fenolo savienojumu atdalīšana īpaši svarīga, jo tie spēj inhibēt ievērojamu skaitu fermentīvo reakciju. Pie zemas sāļu koncentrācijas (<0,5 M NaCl) nukleīnskābju kompleksa piemaisījumi nenogulsnējas un var tikt atdalīti no ūdens šķīduma ar hloroforma ekstrakciju. Hloroforms denaturē olbaltumvielas un atvieglina ūdens un organiskās fāzes atdalīšanu. Parasti ūdens fāze formē augšējo fāzi. Tomēr, ja ūdens fāzei ir ievērojama cietība augstas sāļu (>0.5 M) koncentrācijas dēļ, tā var izveidot apakšējp fāzi. Vēl nukleīnskābes var būt tendētas uz pārviedošanos organiskajā fāzē, ja ūdens šķīduma pH nebija nodrošināts līdz atzīmei pH 7,8 – 8,0.
Ja nepieciešams, hloroforma ekstrakciju atkārto divas vai trīs reizes, lai pilnībā atdalītu netīrumus no ūdens slāņa. Lai iegūtu labāko rezultātu, organisko fāzi var atkārtoti ekstrahēt ar ūdens šķīdumu, kuru sekojoši var pievienot pie pirmā ekstrakta. Kad nukleīnskābju komplekss ir attīrīts, var veikt procedūras noslēdzošo stadiju – nogulsnēšanu.

1.4.3. DNS nogulsnēšana
Noslēdzošajā etapā nukleīnskābes atbrīvo no deterģenta. Šim mērķim ūdens šķīdumu sākumā apstrādā ar šķīdumu priekš nogulsnēšanas, ko veido CTAB maisījums ar augstas koncentrācijas NaCl (>0,8 M NaCl). Sāls ir nepieciešama priekš nukleīnskābju nogulsnēšanas. Nātrija acetāts būtu ieteicamāks nekā NaCl tā bufera īpašību dēļ. Šādos apstākļos deterģents, kurš labāk šķīst spirtā nekā ūdenī, var tikt attīrīts tajā laikā, kad nogulsnēsies nukleīnskābes. Sekojošā apstrāde ar 70% etanolu ļauj veikt papildus attīrīšanu vai arī nukleīnskābju atmazgāšanu no sāls paliekām.
…